バイオ試料の粒子径・濃度測定に適した電気的検知帯法とは
製薬試料は、凝集することで機能を発揮しなくなることや、毒性をもつことがあり、その分散評価はよく行われています。また、ある薬効成分をあるサイズにコントロールすることで目的の部位まで成分を届けるという目的もあり粒子径測定は重要です。
薬効成分の粒子濃度は効力を発揮するための閾値があるため濃度測定も同様に重要な項目です。バイオ試料は、特に新規のものは、量を十分確保することが難しい場合があり分析する際の試料量は少ない方が好まれます。
バイオ試料も含めナノサイズの粒子径の測定法としては動的光散乱法DLSが挙げられます。簡便に数μm以下の粒子径を測定できるため汎用的に使用されてきました。近年ではバイオ分野を中心に、個数濃度を測定する要望が増えており、その手法として、比較的新しい方法であるナノ粒子追跡法NTA nano tracking analyzerの使用が増えております。また主にμm以上が対象でだったコールター法（電気検知帯法）でナノ粒子対応の装置が開発されており、この原理の装置の使用もよく見られます。
ここではバイオ試料の粒子径測定におけるさまざまな測定方法と、ナノ粒子対応の電気検知帯法を用いた手法（弊社取扱いのSpectradyne社 nCS1）の特徴と比較、バイオ関連のアプリケーションを紹介いたします。
バイオ向けナノ粒子径測定原理
・動的光散乱法DLS
ナノ粒子測定で主流の原理。簡便な測定、装置は小型で比較的安価。
1nm ~ 数μm対応。単分散向け。分解能は比較的低く、濃度測定は不可、液体は水系、非水系対応。
レーザーを懸濁液に照射し得られる散乱光のゆらぎから粒子のブラウン運動の速さ（拡散係数）を測定。（運動が速いほど粒子が小さい）。理論式とのフィッティングにより粒子径を解析。
・ナノ粒子追跡法 NTA nano tracking analyzer
数10nm ~ 数μm対応。分解能は比較的高く、個数測定で個数濃度測定可、液体は水系、非水系対応。
レーザーを懸濁液に照射し得られる散乱光を顕微鏡で粒子１個１個を表示させ、粒子のブラウン運動の速さ（拡散係数）を１粒子毎に測定。
・電気検知帯 ナノ対応型
50nm～10μm対応。分解能は高く、個数測定で個数濃度測定可、液体は水（電解液）に限られる。
電解液中の粒子を圧力等で小さい穴（アパチャー）を通過させた際の電気抵抗の差から粒子径を測定（電気抵抗大＝粒子径大）。１粒子毎に測定。１度に測れるサイズ範囲は狭い。
紹介アプリケーション
Extracellular Vesicles and Exosomes 細胞外小胞
Virus ウイルス
Liposomes and Lipid Nanoparticles (LNPs) リポソームと脂質ナノ粒子
Nanoparticle Analysis of Protein Aggregation タンパク質凝集体のナノ粒子分析
Analysis of Gene Therapy Vectors and Nanomedicines 遺伝子治療ベクターとナノメディシン
Measuring nanoparticles in blood serum 血液血清中のナノ粒子測定
Measuring the Cleanliness of Fluid 液体の清浄度、コンタミ評価
Extracellular Vesicles and Exosomes 細胞外小胞
細胞外小胞（EV）は、直径が約30〜10,000ナノメートルのサイズの生物学的粒子です。細胞外小胞は、幅広い物理的特性と生物学的起源を有する多様なタイプの粒子を含み、エクソソーム、エクトソーム、微小胞、微粒子、オンコソーム、およびアポトーシス小体を含みます。細胞外小胞は、免疫応答、機能性タンパク質と核酸の移動、不要な物質の除去、栄養、表面受容体を介した細胞シグナル伝達、および癌転移を含む多くの疾患状態を含む、同様に幅広い生物学的プロセスのセットに関連する役割を持っています。
非常に多くの生理学的プロセスに関与しているため、細胞外小胞は健康と病気の治療法およびバイオマーカーとして大きな可能性を秘めています。これらのアプリケーションでは、細胞外小胞の正確な定量化は、細胞外小胞ベースの製品の安全性と有効性を確保するだけでなく、十分に制御された科学技術の達成のために重要です。
ベシクルやエクソソームの正確な定量
細胞外小胞（エクソソームとしても知られる）の研究は成熟しており、ナノ粒子追跡分析（ナノトラッキングNTA）、動的光散乱（DLS）、調整可能抵抗パルスセンシング（TRPS）などの従来の小胞定量化技術は、この領域で要求される厳格な標準の増加に対応することができません。 エクソソーム定量化のための新しい固定化ベースの方法も、測定前にサンプルを固定するために使用される親和性ベースの技術の複雑さに悩まされています。
Spectradyne社のnCS1は、マイクロ流体抵抗パルスセンシング（MRPS）を使用して、エクソソーム/小胞のサイズと濃度を数分で正確に測定します。 nCS1は高速で使いやすく、全体の分析に必要な貴重なサンプルはわずか数マイクロリットルです。
使用者からの言葉
Mercy BioAnalyticsの共同創設者、Joseph Sedlak様
「nCS1は高速で正確であり、日常のEV定量に簡単に使用できます。他のナノ粒子測定ソリューションを検討しましたが、nCS1は、わずか3uLの体積で対象のすべてのナノ粒子のサイズを測定できる唯一の機器です。 さらに、彼らの顧客サービスは素晴らしく、私たちのnCS1が常にうまく機能していることを保証するために尽力して頂いております。」
より有効な科学技術
エクソソームの生物活性を測定し、異なる生物学的起源の小胞を特徴づけ、小胞バイオマーカーの用途を探求するために、正確な濃度測定は、十分に制御された実験を行うために重要です。
次の図は、SpectradyneのnCS1とNTAおよびゴールドスタンダードであるCryo-TEMとの比較を示しています。 nCS1の測定値は、TEMの測定値と非常によく一致しており、エクソソーム濃度が50nmまで小さい粒子サイズに増加することを示しています。 対照的に、NTAは誤解を招く結果を報告しています。直径200 nmの粒子ではカウント効率の低下が見られ、65nmで10,000倍の誤差が生じます。 重要なことに、NTAは、実際には存在しない直径130nm付近のエクソソームサイズ分布の顕著なピークを報告しています。 差異の理由についての詳細はこのPDFをお読みください。
図１ EVの濃度測定の比較 (青nCS1、緑TEM、赤NTA）
細胞外小胞の定量化にnCS1を選択する研究者はますます増えています。これは、高速で使いやすく、他の方法を使用して取得できるよりも正確な小胞分析を提供するためです。
高純度
サイズ排除クロマトグラフィーまたは超遠心分離によって分離された細胞外小胞の純度は、下流のアプリケーションと分析にとって重要です。 SpectradyneのnCS1は、50 nm以上の高精度なEV濃度結果を提供し、研究者がEV精製プロトコルを適切に特性評価することにより、科学におけるトレーサビリティと再現性を向上させることができます。
図2は、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離された8つのEVフラクションについてSpectradyneのnCS1で得られたサイズの関数としてのEV濃度の分布を示しています。 高分解能な測定は、2つの重要な結論をもたらします。 まず、EVの大部分がフラクション3、4、5に溶出しました。次に、これらの各フラクションにはサンプル内に幅広いサイズの分布が含まれており、特定のサイズ範囲のEVを分離するにはこのサンプルをさらに精製する必要があることを示しています。
図2 分離されたEVフラクション
これらのnCS1測定によって提供された洞察は、ダウンストリーム作業で顧客の大幅な時間の節約を可能にし、他の方法では実際には得られなかったものです。
ウイルス
ウイルスの大きさとは？
ウイルスにはさまざまなサイズと形があります。 肝炎やパルボウイルスなどの一部は、ほぼ球形で直径が50nm未満です。 エボラ出血熱の原因となるウイルスなどの一部は、長さが1μmもの長い柔軟なシリンダーです。 球形で中間サイズのものもあり、直径は75〜300nmの範囲です。
生きた生物学的力価などのウイルスを定量化するための従来の方法は、結果を返すのに数日かかる場合があります。 現代の速いペースの研究とCOVID-19のような現在の例は、より速い測定を必要とします。 基本的なウイルス学、遺伝子治療、疫学など、ウイルス研究の多くの分野の研究者は、ウイルスを測定するためのより現代的なアプローチを探しています。
使用者からの言葉
Gene Therapy Co. Inc.
「私たちは、Spectradyneの現在のMRPSテクノロジーを、治療用レトロウイルスの定量化で提供する価値のために熱心に購入しました。それが提供する結果と、それが私たちの産業プロセスフローにどれほど実際に適合するかに感銘を受けました…」
より有効な科学
ウイルスの感染力を測定し、さまざまなウイルス調製物の免疫原性をテストし、ほとんどすべての下流分析を行うには、十分に制御された実験を実行するために正確なウイルス濃度測定が重要です。レトロウイルス医薬品を段階的に希釈し、サイズの関数として濃度を測定したところ、nCS1の優れた濃度直線性が示されました。
SpectradyneのnCS1によって正確に定量化されたレトロウイルス医薬品の段階希釈。
ウイルス定量にnCS1を選択する研究者はますます増えています。これは、nCS1が高速で使いやすく、他の方法を使用して取得できるよりも正確なウイルスサンプルの分析を提供するためです。
正確で高分解能の粒子濃度測定により、ウイルス調製物の純度を直接定量化できます。 nCS1はサンプル中のすべてのタイプの粒子を測定するため、特定の調製物中の不純物やその他の非ウイルス粒子を定量化するために使用できます。
下の図は、精製の進行段階でのウイルス調製物の測定値を示しています。 サイズ分布のピークから明らかなように、明らかに精製ステップ2は標的ウイルスを大幅に濃縮します。
nCS1を使用したサンプル精製ステップの定量分析により、十分な情報に基づいた意思決定が可能になり、研究開発がスピードアップします。
お客様はnCS1を使用して、次のようなさまざまなウイルスを特徴付けます。
- レンチウイルス
- アデノウイルス
- アデノ随伴ウイルスの凝集体
- バクテリオファージ（PR-772、T4、T3、L-VIR）
- インフルエンザA、B（FluA、FluB）
- 狂犬病
- 単純ヘルペスウイルス（HSV）
- ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
- マウス白血病ウイルス（MLV）
- マウス肝炎ウイルス（MHV）
- 粘液腫ウイルス
nCS1で行われた興味深いウイルス測定に関するデータを下記に紹介します。リンクも参考下さい。
数種のウイルスターゲットの詳細な測定結果の報告です。直径約200 nm〜300nmのレンガ型のビリオンである粘液腫ウイルスの測定が含まれています。一例では、サンプル調製がほとんどない細胞培養培地のまま試験されました。 nCS1は、高濃度の培地バックグラウンドを使用しても、260nmでウイルス集団を簡単に検出できました。もう1つの例は、nCS1を使用して、野生型インフルエンザBウイルス（WT）と変異型の両方を測定した場合です。 3番目の例は、マラバウイルスの測定です。TEMによって、円筒形の直径が約65 nm、長さが約180nmであると報告されています。これらの測定値の詳細については記事をご覧ください。
Liposomes and Lipid Nanoparticles (LNPs) リポソームと脂質ナノ粒子
構造と利用例
リポソームと脂質ナノ粒子（LNP）は、基本的な物理的構造が非常に似ています。 これらは両方とも、体内でドラッグデリバリービヒクルとして使用されます。 従来のリポソームは、水性ポケットを囲む脂質二重層を持っていますが、LNPは通常、内部をカプセル化する単一のリン脂質外層のみを持ち、これは非水性である可能性があります。 医薬品（DP）の担体として、これらは両方とも、外層がDPを外部分解から保護するという明確な利点を提供し、これらの粒子の物理化学的特性を最適化して、薬物送達の場所と速度の特異性を高めることができます。 たとえば、ペグ化などの手法をLNPで使用して、安定性を高め、循環時間を増やして、体内の標的部位により効率的に送達することができます。
mRNA療法などの高度に専門化された薬物ペイロードの送達媒体としてのリポソームおよびLNPの使用は大幅に増加しています。使用が承認された最初のSARS-CoV-2ワクチン（BioNTech / PfizerおよびModerna）は両方ともmRNADPのための送達メカニズムとしてLNPを使用しています。
正確なリポソームとLNPの定量
リポソームまたはLNPを使用することの明確な利点の1つは、両方のタイプの粒子が非常に狭く均一な粒子サイズ分布で製造できることです。 DPデリバリーエンベロープの実際のサイズは、これらの薬剤のターゲティングメカニズムの重要な部分になる可能性があります。 さまざまなサイズの粒子が特定の臓器や組織の種類を標的にすることができ、十分に小さい場合は、血液脳関門を通過して脳に直接送達することができます。
これは、リポソームとLNPの粒子サイズ分布を正確に測定する能力が非常に重要であることを意味します。 SpectradyneのnCS1は、動的光散乱（DLS）やナノ粒子追跡などの光学技術と比較して、粒子サイズのより高解像度の測定を提供します。 同時に、業界をリードする濃度測定も提供します。これは、濃度が投与量に直接相関するため、これも重要です。
上のプロットは、2つのLNPサンプルを、SpectradyneのnCS1と、動的光散乱（DLS）を使用して特性評価された結果です。 DLSは差を得られませんでした。一方、nCS1ではモードサイズ（ピーク径）が明らかに異なり、全体的な分布がまったく異なることがわかります。 nCS1によって検出されたモードサイズの実際の違いは、最終的なDPが目的のターゲットに到達する能力に影響を与える可能性があるため、このモードサイズを正確に知ることは多くのアプリケーションにとって重要です。
上記の2番目の図では、製造プロセスの再現性に注目して下さい。 3つのサンプルは、同一のレシピとプロセス条件を使用して合成されたLNPの3つの異なる製造サイクルを表しています。 nCS1を使用して取得したデータは、3つの生産複製が粒子サイズ分布と全体的な濃度で非常に類似していることを示しています。 対照的に、DLSでは、より大きなサイズの粒子に対して光散乱強度が偏るため実際のサイズを誤って表現してしまい、得られた高いPDIは実際には存在しないばらつきがあることを示します。
DLSの散乱強度による過大評価の説明はこちら
タンパク質凝集体のナノ粒子分析
Spectradyneのマイクロ流体技術により、あらゆる種類のナノ粒子の検出が可能になります。
概要
Spectradyne社の nCS1は、抵抗性パルス検知法の新しい実装を採用して、ナノ粒子を迅速かつ高解像度でカウントしサイズ測定をします。 通常、±3％のサイジング精度が達成され、測定速度は最大10,000粒子/秒です。
文献の引用
「抵抗性パルスセンシングによるサブミクロンタンパク質粒子の特性評価は、高いサイズ分解能をもたらし、粒子数の推定値を提供します。これにより、従来の光散乱技術と比較して、粒子サイズ分布に関するより良い洞察が得られます。」
G.V. Barnett, J.M. Perhacs, T.K. Das and S.R. Kar, Submicron Protein Particle Characterization using Resistive Pulse Sensing and Conventional Light Scattering Based Approaches in Pharm Res. 35, 58 (2018) doi: 10.1007/s11095-017-2306-0
A publication from Bristol-Myers Squibb
タンパク質凝集
nCS1は、タンパク質溶液中の凝集体を検出するための2つの重要な利点を提供します。1つは、１つ１つ粒子を測定すること（アンサンブル平均なし）により、高度な多分散のサンプルについて正確なサイズ分布が得られます。 第二に、非光学的電気的検出法は、低屈折率の造影剤であるタンパク質凝集体が分布に正確に表されることを保証します。
非経口薬の開発と製造における粒子状物質は、常に深刻な問題でした。 生物製剤では、製品の有効性、安全性、免疫原性に対する凝集体や粒子の影響が報告されているため、問題はさらに複雑になっています。 アメリカのFDAの規制では、タンパク質治療における粒子の同定と量の詳細な特性評価を強く推奨しています。
規制では、より大きな粒子（>1μm）の測定が義務付けられていますが、タンパク質凝集体がそれほど大きくなるずっと前に、タンパク質凝集体を検出して特性を評価することが望ましいです。 製剤、加工、保管条件などに関する重要な決定は、薬物のライフサイクル全体でタンパク質の凝集を最小限に抑えることを目的として行う必要があります。
Spectradyne nCS1
SpectradyneのnCS1は、サブミクロンのタンパク質凝集体の正確な定量に最適です。 次の図は、実サンプルを用いてタンパク質凝集を定量化するnCS1の能力を示しています。 さまざまな程度（0、10、20、30、および60分）でストレスが加えられた5つの製剤が、顧客のバイオ医薬品の大企業から提供され、nCS1で「受け取ったまま」分析されました。希釈や添加物は必要ありませんでした。 この場合、nCS1によって測定された濃度の範囲は4桁に及びました。 定量的な結果からストレスの増加がこの配合でより多くの凝集体を引き起こすことが明確に分かります。
SpectradyneのnCS1は、より小さな凝集体の早期検出を可能にします
凝集体は、ストレスに短時間さらされた後でもタンパク質製剤に発生します。 nCS1は、これらの凝集体を他の技術よりも早く、より小さな直径で検出できるため、安定した製剤の開発にかかる時間と費用を節約できます。
タンパク質凝集データの詳細はこちらのPDFでご確認できます。
Analysis of Gene Therapy Vectors and Nanomedicines 遺伝子治療ベクターとナノメディシン
概要
遺伝子治療ベクターとナノメディシンの正確な定量化は、研究と製品開発のすべての段階で重要です。生産段階の特徴を明らかにする場合でも、生物活性を評価する前に正確な力価を取得する場合でも同様です。 nCS1は、すべてのタイプのナノ粒子ベースの治療法を迅速かつ正確に定量化し、測定ごとに3マイクロリットルのサンプルしか必要としません。
ウイルスベースの医薬品の定量化
下の図は、3段階の精製を経て進行する独自のウイルスベースの医薬品のnCS1TM測定値を示しています。 精製の各段階では、広いサイズ範囲で粒子の濃度が増加しますが、第2段階では、ウイルス生成物の明確な濃縮が得られます。 これらの測定により、この製品の製造業者は、精製プロセスの非常に詳細な図と、他の方法では得られなかった最適化の洞察を得ることができました。
遺伝子治療ベクター
nCS1は、光散乱ではなく電気的方法を使用してナノ粒子のカウントとサイズ設定を行うため、すべての粒子タイプを同等に測定します。 その結果、研究者は毎日nCS1を利用して、次のようなさまざまな遺伝子治療ベクターやその他のナノメディシンを測定しています。
・レンチウイルス、レトロウイルス、HSVなど
・脂質ナノ粒子（LNP）
・リポソーム
・高分子ナノ粒子
・粉砕された薬物粒子（API結晶）
SpectradyneのnCS1は、ウイルス精製段階の監視を可能にします。
さまざまな精製段階の後にウイルスベースの医薬品がnCS1によって測定されています。今回の例では、ウイルスの濃縮は、2番目の精製ステップの後ではっきりと観察され、他の技術を使用して直接かつ実際に測定することはできませんでした。 このような高分解能で定量的な測定は、他の技術では得られず、医薬品開発プロセスのすべての段階でプロセスパラメータのより効果的な分析を可能にします。
Measuring nanoparticles in blood serum
液体血清中のナノ粒子測定
nCS1粒子サイズアナライザーは、血清、血漿、およびPBSや他の塩含有溶液などの他の弱導電性分析物中のナノ粒子を分析するために使用できます。
以下に、マウス血漿中のバクテリオファージの陽性検出を示すデータを記載します。 左のプロットは、マウス血漿中のT7ファージの検出データを示しています。 中央のプロットは、有効粒子径のヒストグラムを示しており、バクテリオファージに起因する55nmでの粒子濃度のピークを示しています。 右のプロットは、ブランク血漿（青い破線）、ファージ感染血漿（緑の一点鎖線）、および差（赤い実線）の濃度スペクトル分布（CSD）を示しています。 これらのデータからもファージの直径55nmが得られます。 ピークの積分により、測定されたファージ濃度は5.3×1010粒子/ mlであり、これは生物学的力価によって得られた1.5×1010 pfu / mlに近いです。
Measuring the Cleanliness of Fluids
液体の清浄度、コンタミの評価
生理食塩水中のナノ粒子
ある目的の液体や、特にヒトの循環器系に注入する液体の清浄度は非常に重要です。 この場合、無毒であることに加えて、微粒子は循環系を容易に通過し、プロセスの後、廃棄物として放出されるのに十分なほど小さくなければなりません。 非経口液体中の目に見える粒子 (>100㎛ )と目に見えない粒子 (1 ～100 ㎛) の両方について、厳しい規制要件が既に存在します。過剰な粒子群をクリーンアップするためにフィルターをよく使用しますが、これらはどの程度うまく機能するでしょうか?
ナノメートル (<100 nm) およびサブミクロン (100～1,000 nm) の粒子の信頼できる測定技術が利用可能になるにつれて、これらの粒子サイズ範囲の詳細な精査も期待できます。 現在、製剤中の微粒子に焦点が当てられていますが、Ⅳ生理食塩水などの非経口輸液もモニターする必要があります。
Spectradyne の革新的な nCS1TM ナノ粒子アナライザーは、これらの微粒子の正確な定量化に最適です。
この用途における nCS1 の有効性を実証するために、2 種類の 0.9%生理食塩水の粒子含有量を比較しました。1 つ目はⅣバッグで、2 つ目は充填済みのフラッシュシリンジです。図は、ナノ粒子の 2 つのサイズ範囲、75 ～400 nm および 250 ～1600 nm (挿入図) の結果を示しています。 結果は、充填済みのフラッシュ シリンジ (緑) 内の生理食塩水が袋入りの IV 生理食塩水 (青) よりも清浄であることを明確に示しています。 これらの測定により、ほぼ 6 桁の濃度範囲にわたる幅広いサイズ範囲 (この場合は 75 ～ 2,000 nm) をnCS1はカバーできることが確認できます。下の表は、2 つの異なるサイズ範囲の絶対濃度の結果もまとめたものです。
ナノスケールフィルターの効果の調査
関連する研究では、nCS1 の高解像度を使用して、ナノ医療コンポーネントのフィルタリングの効果を測定しました。細胞分離に使用される強磁性粒子の広い分布を含むサンプルを、公称孔径 0.45 µm のセルロースアセテート膜によるろ過の前後で分析しました。 ポジティブコントロールとして、794 nm ポリスチレンビーズを 2×10７粒子/ml の最終濃度で両方のサンプルに添加しました (コントロールは、ろ過後にろ過したサンプルに添加しました)。
フィルター調査の結果を示します。フィルター処理していないサンプルを青で、フィルター処理をしたサンプルを緑で示しています。 驚くべき結果として、フィルターが定格サイズの 0.45 µm をはるかに下回る多数の粒子を除去することです。 さらに、フィルターは 450 ～ 750 nm のサイズ範囲で粒子除去率が比較的低く、粒子濃度が約 3 分の 1 しか減少しませんでした。これは、フィルターのパフォーマンスが期待よりも比較的低いことを示しています。
本内容の測定ができるnCS1はこちら
nCS1のメーカーSpectradyne社のウェビナーの視聴も可能です。
